Génsebészet

A génsebészet az in vivo genetikát és in vitro technikákat is magában foglaló tudományág. A génsebészet a genetikai örökítő anyag új, mesterségesen létrehozott örökíthető változata, melyhez az idegen eredetű DNS szakaszt akár vírális/bakteriális vagy egyéb vektor-rendszer segítségével juttatják be a gazdaszervezetbe.

Génsebészet - DNS

A vizsgálandó gazdaszervezet örökítő anyagának egy részének (vagy egészének) izolálása és egy azonos vagy eltérő szervezetben történő felszaporítása a klónozás. A DNS élővilágban előforduló általános szerkezetének köszönhetően a klónozás igen konzekvens. A génsebészet elmúlt 35 évben történt fejlődése teljesen átformálta a biológiai tudományokat, szinte nincs is olyan területe, ahol ne alkalmaznának napjainkban rekombináns DNS technikát. Néhány példa:

- Antibiotikumok előállítása overexpresszióval, vagyis az antibiotikum gén termékének fokozott termeltetésével.

- Nem kívánt géntermékek elcsendesítése.

- Orvosdiagnosztikai alkalmazása is jelentős, például a nukleinsav próbák segítségével.

- Génterápia/gene repair lehetőségek a betegségek okainak megszűntetésére és nem csak a tünetek kezelésére.

A biotechnológia, napjainkban egy új iparággá nőtte ki magát.

Golden Rice - Aranyrizs

Természetesen egy génmódosított növénynek nagyon alapos vizsgálat-sorozaton kell átesnie, mielőtt köztermesztésbe kerülne. Paradicsomok esetén például tápérték, toxin termelési szint, vitaminok koncentrációjának a szülői vonalakkal való összehasonlítása szükséges. Az Amerikai Egyesült Államokban engedélyezett a GMO (Genetically Modified Organisms, vagyis Genetikailag Módosított Organizmus) növények termesztése, míg a világ más pontjain, például Európában és azon belül Magyarországon is törvény tiltja előállításukat.

1994-ben, a WHO megállapítása szerint 2,8 millió 0-4 év közötti gyermek szenved A-vitamin hiányából fakadó valamilyen betegségben, rendellenességben (VADD Vitamin A Deficiency Disorders). Ezek között számos látással kapcsolatos probléma van, mint szürkületi vakság, vagy a kornea sebesedése, sérülékenysége. Nem ritkán az A-vitamin hiánya teljes vaksághoz is vezethet. A szubklinikus vitaminhiány legalább további 250 millió gyereket érint, továbbá terhes vagy szoptatós édesanyákat veszélyeztet. India, Banglades, Afrika számos országa valamint dél-ázsiai országok a legveszélyeztetettebb helyek, itt jellemzően éhezés, hiányos táplálkozás illetve kizárólag rizs fogyasztása okozza a problémát. Az emberi és állati szervezetek többsége az A-vitamint a karotinoidokból, leginkább a ß-karotinoidokból állítja elő. Ez a narancssárga, növényi eredetű pigment az emberi szervezetben transz-retinollá alakul. Zsíroldékony cisz-retinol az opszinokhoz kapcsolódva képezi a rodopszint a retina pálcika sejtek sejthártyájában. Ezek a sejtek a felelősek az alacsony fényintenzitásban való látásért. A retina csap sejtjeiben létrejövő komplexek pedig a színlátásért és erősebb fényben való látásért felelősek. Megfelelő hullámhosszú fény hatására a pálcika és csap sejtek rodopszinja konformáció változáson megy keresztül, mellyel akciós potenciált generálnak. Ez az akciós potenciál halad aztán neuronról neuronra és jut el az agy megfelelő területére. De az A-vitaminnak sok egyéb szerepe is van az emberi metabolizmusokban.

A legkézenfekvőbb stratégia az A-vitamin hiány elleni küzdelemben tehát az élelmiszerekben való ß-karotin szint növelése volt. A választás a rizsre esett, hiszen sok országban, ahol VADD-ben szenvednek az emberek, ez az egyetlen, széles körben elérhető élelemforrás. Potrykus és Beyer készítete el az Aranyrizsnek nevezett megemelt ß-karotin szinttel bíró rizst (a színe alapján nevezték így). A rizs termés endospermiumában kellett kifejeztetni a transzgént, mivel rizsliszt készítése során, az őrlés után ez a rész marad meg legnagyobb mennyiségben. (a rizs maga egyébként az olajban gazdag aleuron rétegben tartalmaz ß-karotint, de ezt a részt a feldolgozás során eltávolítják, mivel hosszabb tárolás során avasodás következik be).

Számos technikai problémát vetett fel az aranyrizs elkészítése: a rizsben a ß-karotin geranil-geranil-difoszfát [GGPP] készletből készül, mely izoprén vázas vegyület és számos más anyag alkotója, előanyaga. 3 enzim szükséges a GGPP átalakításához, de a rizs endospermiumában egyik sem aktív. Egy amerikai kutatócsoport 2 gént klónozott egy bakteriális eredetű plazmid vektorba: a fitoén szintáz és a fitoén deszaturáz enzimek génjét. Egy másik gént, likopén ß-ciklázt egy külön plazmidba klónozták, melynek szelekciós markere a higromicin rezisztencia génje. A géntranszferhez az Agrobacterium tumefaciens-t használták fel. A vektorokat külön-külön juttatták be a már említett, növényi sejteket fertőző baktériumfajba, és a sikeresen transzformált baktériumokkal együtt, egyszerre inkubálták a rizs embriókat laboratóriumi körülmények között. Ezután a szelektált sejtek tenyészetéből regenerálták a GM növényeket, melyeket érésig neveltek. A rizsterméseket összegyűjtötték. Nem minden szem volt ß-karotinban gazdag, de átlagosan 1,6 ľg/g száraztömegre vonatkoztatott mennyiséget kaptak. Napi 300 g Aranyrizs elfogyasztásával fedezhető a napi provitamin szükséglet.

Az Aranyrizs természetesen nem csodaszer: optimális felszívódásához szükséges bizonyos koncentrációban zsírsavak jelenléte, melyek nélkül a provitamin felszívódás nélkül kiürül a szervezetből.

Aranyrizs változatok

Az elmúlt években már második generációs Aranyrizst is előállítottak, még magasabb ß-karotin tartalommal.

A transzgénikus állat egy mesterségesen előállított és bejuttatott idegen gént hordoz a genomjában. Az idegen gén előállításához rekombináns DNS technikákat alkalmaznak. A struktúrgénen kívül a beültetett DNS más, a működéshez szükséges szekvenciákat is tartalmaz, amelyek biztosítják például:

- hogy az idegen gén beépüljön a gazda DNS-ébe,

- hogy helyesen fejeződjék ki a gazda sejtjeiben,

- transzgénikus juh és kecske esetében azt, hogy az idegen gén terméke a tejben termelődjék és a tejmirigyekben választódjék ki,

- transzgénikus csirkében, hogy az idegen géntermék, pl. a humán fehérje a tojásfehérjében szintetizálódjon.

Ezek az állatok értékes forrásai nélkülözhetetlen humán gyógyászati jelentőségű fehérjéknek és terápiás lehetőséget biztosítanak gyógyíthatatlan betegeknek.

2000 júliusában született meg DOLLY, az első transzgénikus bárány, mely humán eredetű gént hordozott a genomjában, olyan helyen, hogy ott megfelelően tudott működni is.

Kétféle transzgénikus állat előállítási módszer ismeretes:

1. Embrionális őssejtek (ES) transzformációja, a transzformált őssejtek hólyag-csíra állapotú embrióba juttatása, majd az embrió visszaültetése az anyába.

2. A transzgénnek a megtermékenyített petesejtbe injektálása.

De mire is szolgálnak még ezen kívül az ilyen transzgénikus állatok? Ha egy fluoreszcens fehérjét, például a GFP-t hozzákapcsolunk egy génnek a kifejeződéséhez, amelynek a szöveti eloszlását szeretnénk vizsgálni az embrionális fejlődés, az állat élete vagy egy adott betegség folyamán, akkor ezt nagyon szépen láthatjuk gerjesztő fény alatt élő sejtekben is. A GFP nem változtatja meg az adott fehérje funkcióját, csak jelzi a jelenlétét, és azt is, hogy milyen mértékben termelődik az a géntermék. A fluoreszcencia ott jelenik meg, ahol a kimutatni szándékozott fehérjénk expresszálódik. Ettől nyert igazi értelmet a felhasználása. De mindez elősegített sejttranszplantációs vizsgálatokat, vagy éppen segíti az őssejt kutatást is. Ez a technika akkora karriert futott be, hogy ma már igen elterjedt lett a tudományos laboratóriumokban.

GFP-vel színezett kisegér

A zöld fluoreszcens fehérje génjét eredetileg egy olyan másik génhez kapcsolták, mely az adott élőlény minden egyes testi sejtjében kifejeződött. A technikát egérben 1997-ben írták le először japán kutatók a FEBS Letters című biokémiai lapban. Eredetileg a béta-aktin promóterének a szabályozása alá helyezték a GFP-t. A promóter olyan génszakasz, amely egy gén kifejeződését szabályozza. Az egér mindenütt fluoreszkált gerjesztőfény alatt, ahol a béta-aktin kifejeződött, így az egér összes szövete ilyen volt, kivéve a vörösvértestjeit és a szőrszálait.

Az Aranyrizs előállításánál láthattuk, hogy a szükséges gének növényi sejtbe történő beépítéséhez a rizs egyik természetes kórokozóját, az Agrobacterium tumefaciens-t használták fel. A géneket kódoló DNS szakaszokat első lépésként a baktérium sejtbe juttatják elektroporációval, vagyis elektromos feszültség alkalmazásával. A második lépésben specifikus kórokozójaként a baktérium fertőzi meg igen hatékonyan a növényi sejtet, bejuttatva a kérdéses géneket a növényi sejtekbe.

A DNS bejuttatásának a gazdasejtekbe számos egyéb módja is van. Manapság - főleg állati és emberi sejtek esetében - igen elterjedtek a különféle virális vektorok. Az eljárás során a vírusok természetes fertőzőképességét használják ki: a sejthez abszorbeálva a vírus partikulumba pakolt DNS (vagy maga a partikulum is) bejut a sejtbe, bejuttatva ezzel az idegen genetikai anyagot. A vírusok nagy hatékonyságú fertőzőképességgel rendelkeznek, nagymértékű replikációs és génexpressziós képességüknek köszönhetően nem csak sejtkultúrák expressziós rendszereként használhatók, hanem élő állat sejtjeinek esetében is.

A human génterápiában alkalmazott vírusoknak 4 osztályát különböztetjük meg:

- Retrovírus-

- Adenovírus-

- Herpesvírus-

- Adeno-társult vírusok-

Ezek közül manapság igen elterjedtek a retrovirális, azon belül is a lentivirális génbeviteli eljárások. A lentivírusok rendszertanilag a Retroviridae családba, az Orthoretrovirinae alcsaládba, és a Lentivirus genusba tartoznak. A burokkal rendelkező vírusok belépése a sejtbe általában fúzióval történik, míg a burok nélküli vírusoké tipikusan receptor-mediált endocitózissal, de ilyen mechanizmus burokkal rendelkező vírusok esetében is van. A retrovírusok kötődése receptor-antireceptor kölcsönhatás, ami alapvetően befolyásolja a vírus sejttropizmusát. A replikáció-kompetens retrovírusok burokfehérje-komplexe két részből, egy külső glikozilált hidrofil polipeptidből (SU) valamint egy transzmembrán fehérjéből (TM) áll. Mindkét fehérjét az env gén kódolja, és polipeptid formában szintetizálódnak, mely proteolitikusan hasad. A retrovírusok érett burokfehérjék nélkül nem fertőzőképesek. A lentivírusok jelentős mennyiségű genetikai információt képesek bejuttatni a gazda sejt DNS állományába, és a retrovírusok közül kiemelt képességük, hogy nemcsak osztódó sejtekben képesek replikálódni. A sejtek transzdukciójára gyakran használt lentivírusok már genetikailag módosított, szaporodásképtelen HIV-1 alapú vektorok. Ez azt jelenti, hogy bár a virion strukturális és enzimatikus komponensei HIV-1 eredetűek, az env gén a heterológ vesicular stomatitis virusból (VSV) származik. Ezek a burokfehérjék már a sejtfelszíni sziálsavakhoz kötődve igen széles tropizmust eredményeznek, tehát nagyon sok különféle típusú állati sejt fertőzését teszik lehetővé.

Transzdukció

A HIV-1 alapú, genetikailag módosított lentivírus vektorral történő transzdukció az egyik leghatékonyabb módja egy adott gén bevitelének a cél DNS-be. Segítségével lehetőség nyílik különféle transzgének vagy génelcsendesítést irányító rövid hajtű RNS-ek, shRNS-ek hatékony cél DNS régiókba juttatására és integrációjára, valamint stabil vagy kontrollált expressziójára osztódó sejtek esetében éppúgy, mint nem osztódó sejteknél. Az alapkutatások számára és a különféle emberi megbetegedéseket célzó génterápiában is izgalmas lehetőségeket nyújt in vitro vagy némely szerv esetében in vivo egyaránt.

2013. január