A mezenchimális őssejtek szerepe a tumorképződésben

Az immunitás, gyulladás és a rák kapcsolata - alapvető tények

A gyulladásos válasz meghatározó szerepet játszik a tumorok kialakulásának különböző szakaszaiban, beleértve a kialakulást, a malignus átalakulást, előrehaladást, az invazációt és a metasztázist is.

A mezenchimális őssejtek szerepe a tumorképződésben

Immortalizált kötőszveti sejtek

Az immunsejtek, melyek a tumorba infiltrálnak, széleskörű és dinamikus kapcsolatot alakítanak ki a rákos sejtekkel. Számos olyan molekuláris mechanizmust/eseményt tártak fel, mely közvetíti ezt a párbeszédet. Tény, hogy a gyulladásos környezet esszenciális eleme minden tumornak. Számos, környezeti okra visszavezethető (90 %-a a tumoroknak), a tumorhoz társul a gyulladás valamelyik formája (virális/bakteriális fertőzés, dohányzás, elhízás). A gyulladás következtében a tumorok környezete a ráksejtek mellett tartalmazza a veleszületett immunrendszer sejtjeit (makrofág, hízósejt, neutrofil granulocita, mieloid szupresszor sejt, DC, NK sejt) és az adaptív immunrendszer sejteit (T és B sejtek). A körülöttük lévő strómában találhatóak még fibroblasztok, endotél sejtek, MSC-k (Mesenchymal stem cell - mezenchimális őssejt) és periciták is. A gyulladásos környezetben megtalálható immunsejtek legtöbbje egyrészt a tumor kialakulást indukáló, másrészt antitumor tulajdonságokkal is bír. Fontos kiemelni, hogy a tumor kialakulásához hozzájáruló gyulladás és az antitumor immunvédelem egyidejűleg van jelen a tumornövekedés különböző pontjaiig, majd ezt követően ez az egyensúly eltolódik valamerre. Az irányt a mikrokörnyezetben jelenlévő immunmediátor- és modulátor molekulák, valamint a különböző aktivált sejttípusok mennyisége fogja meghatározni.

A tumorok mikrokörnyzetében leggyakrabban megtalálható immunsejtek a tumor asszociált makrofágok (TAM) és a T-sejtek. A TAM-ok az egyik legfontosabb résztvevői a daganatokhoz fűződő gyulladási folyamatoknak (Mantovani et al., 2008). Főleg a tumor növekedéséhez járulnak hozzá, de az angiogenezishez, az invázióhoz és a metasztázishoz is elengedtehetlenek (Condeelis and Pollard, 2006). A tumorok magas TAM tartalma általában összefüggésben van a rossz prognózissal (Murdoch et al., 2008). A mellráknál például a Th2 típusú CD4+ T-sejtek serkentik a mellrák progresszióját és a metasztázist, azzal, hogy ráveszik a TAM-okat, hogy proangiogén és prometasztatikus faktorokat termeljenek (DeNardo et al., 2009). A makrofágok alapvetően két csoportba sorolhatók, M1 és M2 (Sica et al., 2008) típusúak. Az M1-es makrofágok, melyeket az IFNγ és mikrobiális anyagok aktiválnak, nagymértékben expresszálnak proinflammatorikus citokineket (TNFα, IL-1, IL-6, IL-12, IL-23), MHC molekulákat és NO szintázt. Ezen kívül képesek elpusztítani a patogéneket és antitumor választ kezdeményezni. Ezzel szemben az M2 makrofág, melyet in vitro körülmények között IL-4, IL-10, IL-13 citokinekkel lehet indukálni, leszabályozza az MHC II expressziót és IL-12 termelést, valamint megnöveli az IL-10 anti-inflammatorikus citokin, a scavanger receptor A és argináz expresszióját. A legtöbb TAM-ot M2 makrofágnak tartják. Az M2-es típus a tumor angiogenezist és szöveti átrendeződést segít elő (Sica et al., 2008). Az M1 és M2 makrofágok plasztikusak és fenotípusukat inkább a génexpressziós profiljuk alapján határozzák meg, mintsem, hogy melyik differenciálódási úton keletkeztek vagy milyen sejtfejlődési utat választottak.

Mezencimalis őssejtek a tumorszövetben

A mezenchymalis őssejtek szinte mindegyik szövettípusban megtalálhatóak és központi szerepet játszanak a szövetregenerációban, sebgyógyulásban, valamint a szöveti homeosztázis fenntartásában. Az MSC-kről már tudjuk, hogy nagyon hatékonyak számos immunrendszert érintő zavar és degeneratív betegség kezelésében in vivo, mind állat modellek, mind pedig ember esetében. Mostanában számos esetben bebizonyosodott, hogy az MSC-k és az immunrendszer számos sejttípusa között szoros interakció jellemző. Ez a T és B limfocitákat, dendritikus sejteket, monocitákat/makrofágokat, NK sejteket is érinti, ezen kívül a hematopoetikus progenitor sejtek niche-jének is a fő komponensei a csontvelőben. Az MSC a tumor strómát alkotó egyik fő sejttípus is egyben és úgy tűnik, hogy a tumor-asszociált fibroblasztok prekurzorai is MSC-k. A tumorszövetbe számos típusú immunsejt infiltrációja is megfigyelhető, ezek együtt a támogató stróma sejtekkel karöltve alkotják a tumor mikrokörnyezetét. Ebben a környezetben az MSC-k gyakran folyamatosan ki vannak téve az immunsejtek által termelt gyulladásos citokineknek/kemokineknek, és ezáltal valószínűleg új funkciókra tesznek szert, mely funkciók a normális szöveti őssejtek esetében nem figyelhetők meg. Ezek az egyedi funkciók szerepet játszhatnak a tumor mikrokörnyezet megváltoztatásában, modulálásában és ebből kifolyólag hatással vannak a tumorprogresszióra is. Néhány újabb tanulmány arra is rámutatott, hogy az MSC-k bizonyos szolubilis faktor szekréciójával, mint például a CCL-5 kemokin, hozzájárulhatnak a rákos sejtek metasztázisához, bár ennek részletes mechanizmusa még nagyrészt ismeretlen.

A legtöbb ezzel foglalkozó tanulmány xenotranszplantációs tumor-modellt alkalmazott, a kísérletekhez immundeficiens egereket használtak. Ezeknél a modellrendszereknél - bár kétségtelenül kiválóan tanulmányozható az MSC-k tumorfejlődésre gyakorolt hatása - az adaptív immunrendszer sejtjeinek hiánya gátat szab annak teljes körű megértéséhez, hogy hogyan is hatnak az MSC-k, az adaptív és veleszületett immunrendszer sejtjei összességében a tumorprogresszióra. Ebben a cikkben tumor stróma MSC-ket (limfóma eredetű MSC-k, L-MSC-k) izoláltak spontán kialakult limfómákból és jellemezték ezek tumor kialakulást elősegítő aktivitását szingén tumor transzplantációs modell-rendszerben. Ezt követően tanulmányozták az L-MSC-k hatását a befogadó szervezet adaptív és veleszületett immunválaszára, összehasonlítva a normál szöveti őssejtek hatásával.

Egy rangos, meglehetősen új tudományos cikk eredményei

Az L-MSC-k sokkal hatékonyabban elősegítik a tumor növekedést, mint a csontvelői MSC-k (BM-MSC-k)

A kísérletekhez spontán kialakult limfómákból izoláltak MSC-ket (L-MSC) olyan egerekből, melyekben a p53, FasL vagy MutL homológ 1 gének vagy ki voltak ütve (knock-out), vagy a mutáció csak az egyik allélt érintette (heterozigóta mutáns). A szarkóma és a karcinóma sejtekkel ellentétben a limfóma sejtek nem adherens sejtek, így könnyedén elkülöníthetőek a tumorban lévő L-MSC-től, melyek plasztik adherensek. A kísérletekhez számos L-MSC sejtvonalat előállítottak, a sejteket a BM-MSC-k izolálási protokolljának módosításával nyerték ki a tumorokból. Kontrol sejtként BM-MSC-ket is izoláltak, természetesen mindig ugyanabból az állatból, melyekből az L-MSC-k is származtak. Mindkét típusú MSC ugyanolyan orsószerű morfológiát mutatott, kolónia képző kapacitásuk és differenciálódási képességük is megegyezett. A sejtfelszíni antigén mintázatukban sem találtak eltérést, továbbá a vimentin és fibroblaszt specifikus protein 1 (FSP1) alacsony expressziója arra utal, hogy ezek a limfóma asszociált MSC-k nem myofibroblasztok, melyek még gyakran megtalálhatók a tumor strómában.

Annak megállapítására, hogy az L-MSC-k felgyorsítják-e a tumor növekedését, L-MSC-ket izoláltak olyan primer limfómákból, melyek p53+/-, FASL(gld/gld), vagy Mlh1-/- mutációkat hordozó C57BL/6 egerekben képződtek. Ezeket az MSC-ket ezután immunokompetens, szingén wt C57BL/6 egerek hátsó lábába (izomba) injektálták EL4 sejtekkel együtt. EL4: T-sejtes limfóma, mely szintén C57BL/6 egerekből származik. Kontrollként a megfelelő típusú limfómát hordozó (p53+/-, gld/gld, vagy Mlh1-/-) vagy a vad típusú egerek BM-MSC-i szolgáltak. Az EL4 és L-MSC koinjektálást követően azt tapasztalták, hogy az L-MSC-k a kontrolként használt BM-MSC-kel ellentétben erőteljesen felgyorsították a tumor növekedést. A BM-MSC-k és a L-MSC-k önmagukban nem idéztek elő tumorképződést. A tumorképződés 7. napján megvizsgálták a tumorban lévő MSC-k előfordulási gyakoriságát, és ugyanolyan százalékos értékeket kaptak, mint a spontán differenciálódott tumorok esetében.

Megvizsgálták normál, felnőtt egérszövetből származó MSC-k hatását is (bőrszövetből izolálták), de a BM-MSC-khez hasonlóan nem találtak bizonyítékot arra, hogy ezen MSC-k jelenléte elősegítené a tumor növekedését. A tumor növekedéséért nem lehetnek felelősek a p53, FasL, vagy Mlh1 gének mutációi, hiszen a megfelelő mutációkat a BM-MSC-k és a bőrből izolált MSC-k is hordozták.

Az L-MSC-k és a BM-MSC-k hasonlóképpen modulálják a befogadó adaptív immunrendszert

Már ismert, hogy az adaptív immunsejtek és az általuk termelt gyulladásos citokinek valószínűleg meghatározzák az MSC-k funkcióját. Az adaptív és veleszületett immunrendszer sejtjei egyaránt nagy mennyiségben fordulnak elő a tumorban a növekedés minden stádiumában, így a szintén ott lévő MSC-kre is hatással vannak. A továbbiakban az MSC-k és a befogadó immunrendszer közti interakciót vizsgálták, és ettől kezdve a p53+/- egér L-MSC-inek hatását hasonlították össze a szingén C57BL/6 egérből származó BM-MSC-kel.

Először is számos limfocitapopuláció előfordulását monitorozták olyan tumorokban, melyeket EL4 sejtek (kontrol), vagy EL4+BM-MSC ill. EL4+L-MSC injektálásával állítottak elő. A tumorszövetben és a perifériás vérben egyaránt nagyon lecsökkent a T és B sejtek száma MSC-k jelenlétében, függetlenül attól, hogy limfómából származtak vagy csontvelőből. Tehát meglepő módon mindkét MSC hatékonyan redukálta a limfociták számát mind a tumorban, mind a perifériás vérben az összes mintavételi időpontban. Ezen kívül szintén hasonló mértékben csökkent mindkét MSC esetében azon citokinek szintje is, melyek meghatározóak a tumorsejtek elleni celluláris immunválaszban: IFNg és IL12. Ezek alapján elmondható, hogy az L-MSC-k hatékonyabb tumornövekedést serkentő kapacitása nem az adaptív immunválasz gátlása miatt lép fel, hiszen erre a BM-MSC-k is képesek. Ismert korábbról továbbá, hogy a BM-MSC-k NO termelésével szupresszálják a T sejtek funkcióját, ezt a proinflammatorikus citokinek váltják ki. Ezzel kapcsolatban azt találták, hogy a L-MSC-k is NO segítségével gátolnak, de nem gátolták hatékonyabban a T sejt proliferációt, valamint a citokinek termelését sem, mint a BM-MSC-k. Érdekes, hogy NO blokkoló (1400W) jelenlétében a BM-MSC-k tumornövekedést serkentő hatása megszünt, de az L-MSC-k továbbra is serkentették a tumor növekedést. Ebből az következik, hogy az L-MSC-k tumornövekedést serkentő hatásáért nem a NO termelés felelős.

Az L-MSC-k a BM-MSC-knél sokkal hatékonyabban toboroztak mieloid sejteket az EL4 transzplantációs modellben

Újabban kimutatták, hogy némely immunsejt, mint a myeloid-derived supressor cells (MDSC) és a tumor-asszociált makrofágok (TAMs) kulcsszerepet játszanak a tumorsejtek elleni immunitás modulálásában. MDSCs: Neutrofil granulociták és monociták, ezek funkciója nagyban eltér. TAMs: Gyulladásos CD206- M1 típusú és gyulladásgátló CD206+ M2 típusú makrofágok. Megvizsgálták, hogy az L-MSC-k és a BM-MSC-k hogyan hatnak ezekre a sejtekre ebben az EL4 transzplantációs modellben. Míg pl. a dendritikus sejtek száma nem változott, az L-MSC-k hatására a tumorban és a perifériás vérben egyaránt jóval több neutrofil, monocita és makrofág van jelen.

Tudvalevő, hogy MSC-k jelenlétében a makrofágok preferenciálisan M2-típusúvá differenciálódnak. Ebben a kísérleti körülményben a CD206+ és CD206- makrofágok arányát nem befolyásolta az MSC-k jelenléte vagy hiánya. Ezután friss tumorokból (L-MSC+EL4) izoláltak makrofágokat és megvizsgálták az M1/M2 génexpressziós profiljukat: IL12low, IL10high, TNFa low, MHCII low. Ez inkább M2-es típusú genetikai mintázat a kontroll makrofágokkal összehasonlítva. Az L-MSCk miatt fellépő myeloid sejtszám emelkedés a tumorban hamarabb megfigyelhető, mint a perifériás vérben, ahol a sejtszám emelkedés késik. Az is elmondható, hogy az L-MSC+EL4 modellben jóval több myeloid sejt vándorolt a tumorszövetbe, mint a BM-MSC-EL4 modellben.

A monociták/makrofágok felelősek az L-MSC-k tumornövekedést serkentő hatásáért

Elsőként Ly6G neutralizáló antitest segítségével specifikusan eltávolították a neutrofil granulocitákat a tumorszövetből és a perifériás vérből in vivo anélkül, hogy a monociták és makrofágok számát megváltoztatták volna. Bár az MDSC-kről tudvalevő, hogy részt vesznek a tumor-asszociált immunszupresszióban és angiogenezisben, ebben a kísérleti rendszerben ezen sejtek hiánya nem volt hatással az L-MSC által indukált tumor növekedés sebességének emelkedésére.

A következő kísérletben CD11b-DTR transzgén egeret alkalmaztak annak érdekében, hogy szelektíven eltávolítsák a monocitákat/makrofágokat. Diftéria toxin adásakor az érintett sejtek száma drasztikusan lecsökkent mind a tumor belsejében, mind a perifériás vérben. Az eredmény meglepő: az L-MSC-k tumornövekedést serkentő hatása teljesen megszűnt a monociták/makrofágok jelenlétének hiányában. Ebből az látszik, hogy a monociták/makrofágok kulcsszerepet játszanak az L-MSC-mediált tumornövekedés serkentésében.

A CCR2-mediált monocita/makrofág jelátvitel játssza a főszerepet az L-MSC-k tumornövekedést indukáló hatásában

Az L-MSC-k jóval hatásosabbnak bizonyultak a monociták/makrofágok tumorszövetbe történő toborzásában, mint a BM-MSC-k. Valószínűsíthető, hogy a monocita/makrofág vándorlását kemotaktikus faktorok irányítják. A következőkben számos citokin, kemokin és növekedési faktor jelenlétére nézve vizsgálták meg a BM-MSC-k illetve az L-MSC-k felülúszóját. Módszer: Luminex-based multiplex bead array system. Azt találták, hogy az L-MSC-k esetében számos citokin és kemokin szignifikánsan nagyobb mennyiségben volt jelen a felülúszóban, mint a BM-MSC-k felülúszójában: IL5, IL6, CXCL10, CXCL1, CCL2. Ugyanez vonatkozott a VEGF-re is. A CCL2 szintje az L-MSC-k felülúszójában extrém magas volt a BM-MSC-kéhez képest. Ez a kemokin kulcsszerepet játszik a monociták migrációjában. Tehát a L-MSC-k által termelt kemokinek felelősek a monociták/makrofágok tumorszövetbe történő vándorlásában. Kvantitatív PCR segítségével a CCL7 és a CCL12 transzkripciós szintjének szignifikáns megemelkedését is kimutatták az L-MSC-k esetében a BM-MSC-khez képest. Mindhárom kemokin a CCR2 liganduma. A CCR2 receptorok a monocitákon/makrofágokon expresszálódnak, a kemotaxis tehát a receptor ligandumainak irányába, a tumorba vezeti a monocitákat. A kemotaktikus aktivitás nagymértékben CCR2-függő, mivel a kemotaxis szignifikánsan csökkenthető a receptort blokkoló antitest hozzáadásával. A CCR2 kiütésével az L-MSC-k szignifikánsan kisebb hatékonysággal vonzották a makrofágokat az EL4 tumorokba. Az MSC-ket és tumorsejteket ezután CCR2-knockout egerekbe oltották. Mind a perifériás vérben, mind a tumorban szignifikánsan alacsonyabb volt a monociták/makrofágok száma, a granulocitáké viszont kissé megemelkedett, akár a CD11b-DTR egérmodellben. Az LMSC-k tumornövekedést serkentő hatása megszűnt.

A TNFa-val előkezelt BM-MSC-k az L-MSC-khez hasonlóan elősegítették a tumor növekedését

Az L-MSC-k valószínűsíthetően BM-MSC-kből származnak. Több tanulmány is rámutatott, hogy a tumorsejtek, strómasejtek és immunsejtek különböző stimulusainak hatására a BM-MSC-k képesek a tumorba vándorolni. Kísérlet: C57BL/6 egerek csontvelőjét besugárzással elpusztították, majd csontvelőátültetést végeztek. A donor csontvelő GFP transzgén egérből származott. A tumor-asszociált MSC-k elég nagy hányada GFP pozitívnak bizonyult, tehát a csontvelőből származott. A fő különbség az L-MSC-k és BM-MSC-k között a citokin/kemokin termelésük mintázatában áll. Ebből adódik eltérő képességük a monociták/makrofágok migrációjának befolyásolására is in vivo. Jogos kérdés, hogy mi okozza a BM-MSC-k megváltozását, miután a tumor mikrokörnyezetébe érkeznek? A gyulladás kritikus szerepet játszik a tumorprogresszió minden stádiumában. A gyulladásos citokinek kulcsszerepet játszanak számos strómát alkotó sejttípus és immunsejt funkciójának befolyásolásához. A BM-MSC-ket többféle gyulladásos citokinnel kezelték - IFNg,TNFa, IL1, IL6 és GM-CSF ? de az L-MSC-khez hasonló citokin/kemokin termelési mintázatot csak a TNFa-nál kaptak. Valójában a TNFa egyfajta mester-regulátora a tumor-asszociált gyulladásnak, hatását az NF-kB jelátviteli úton keresztül fejti ki, és kulcsszerepet játszik a tumorprogresszió szabályozásában. A TNFa-kezelt BM-MSC-k az EL4 tumor modellben ugyanúgy elősegítették a tumornövekedést, mint az L-MSC-k, és a wt-BM-MSC-nél több makrofágot vonzottak a tumorszövetbe. CD11b-DTR valamint CCR2-KO egerekben ezek a tulajdonságok az előkezelt BM-MSC-knél is elvesztek, akárcsak az L-MSC-k-nél.

MSC-makrofág interakciók spontán limfómákban és transzplantált szolid tumorokban

A tumor transzplantációs modellek után a következő kísérletek során a spontán limfómák esetében vizsgálták azt, hogy szintén fennáll e az ilyesfajta kapcsolat az MSC-k és makrofágok között. 12 spontán, p53-/- egerekből származó T sejtes limfómát és 15 spontán, gld/gld egérből származó B sejtes limfómát vizsgáltak meg. A tumorban jelenlévő L-MSC-k és F4/80+ makrofágok száma között szignifikáns korrelációt sikerült kimutatniuk, viszont a Ly6G+ neutrofilek és L-MSC-k száma egymással nem korrelált. Külön kiemelendő, hogy a spontán limfómák közül a kisebb méretű tumorokban jóval nagyobb a tumor-infiltráló MSC-k száma, mint a nagyobb tumorokban, tehát az L-MSC-k valószínűleg a tumorfejlődés korábbi stádiumában játszanak kulcsszerepet.

A limfómák jellege nagyban különbözik más malignus tumorokétól, pl. a carcinomák vagy melanómák karakterisztikája teljesen más. A következőkben a vizsgálatokat ezekre a tumorokra is kiterjesztették, B16 melanóma és 4T1 emlő karcinóma modelleket is megvizsgáltak. Azt találták, hogy a TNFa előkezelt BM-MSC-k az F4/80+ makrofágok bőséges akkumulációját idézték elő a tumorban mind a melanóma, mind pedig az emlő karcinóma modellben a kontroll, kezeletlen MSC-khez képest, és jelentős tumornövekedést serkentő hatásuk volt, mely tulajdonságuk a CCR2 szignalizáció hiányában eltűnt

Összefoglalás

  • A tumor infiltrált MSC-k és az immunsejtek közötti interakció elősegíti a tumorprogressziót.
  • A normál szöveti őssejtek a tumor mikrokörnyezetébe vándorolnak és állandó jelleggel ki vannak téve a lokális immunválasznak és a gyulladásos faktoroknak. Emiatt az MSC-kben számos citokin/kemokin overexpressziója indukálódik, melyek között megtalálható több CCR2 ligand is. Ezeken a kemotaktikus faktorokon keresztül a megváltozott tulajdonságú L-MSC-k képesek egyre több monocitát/makrofágot ill. neutrofilt a tumor mikrokörnyezetébe vonzani. Az MSC-k NO-mediált immunszupresszáns hatása az adaptív immunrendszer sejtjeit gátolja, bár ennek jelentősége kisebb a tumor progresszió szempontjából.
  • A TAM és MDSC sejtek immunszupressziós és angiogenezist indukáló aktivitása kulcsfontosságú a tumor progresszióban. Nyilvánvaló, hogy az MSC-k hatása mindkét csoportot érinti, de az L-MSC-k növekedést serkentő hatásában csak a CD11b+Ly6C+ monociták (MDSC) és a makrofágok nélkülözhetetlenek. A CD11b+Ly6G neutrofileknek (MDSC) nincs hatása a tumor növekedésére, szerepük valószínűleg a tumorprogresszió más aspektusaiban rejlik, mint pl. a metasztázis, hiszen kimutatták, hogy a TGFb szignalizáció révén az emlőcarcinóma sejtek metasztázisát elősegítik.
  • Több tanulmány rámutatott, hogy az MSCk által termelt CCL2 kemokin esszenciális a B és CD4+ T-sejtek funkciójának gátlásában, kísérletes egér autoimmun enchefalomyelitis rendszerben.
  • A gyulladásos folyamatokra már hosszú ideje a tumor progresszió kulcs regulátoraként tekintenek. Némelyik tumor sűrűn fordul elő fertőző megbetegedésekkel vagy egyéb krónikus gyulladásokkal, ugyanakkor azoknál, akik gyulladásgátló kezelést kapnak, a rák előfordulása kevésbé gyakori.
  • A gyulladás számos immunsejt infiltrációját elősegíti a tumorba és a gyulladásos citokinek jelenléte alapvetően befolyásolja a tumor strómát. A TNFa termelés L-MSC fenotípussal ruházza fel a normál BM-MSC-ket, és gyorsítja a tumor növekedését és növeli malignicitását a monociták/makrofágok toborzásán keresztül.
  • Az eredmények alapján az MSC-k terápiás alkalmazásánál érdemes nagyon alaposan megfontolni, hogy milyen citokin/kemokin termelési mintázattal rendelkező MSC populációt használnak.

A mezenchimális őssejtek szerepe a tumorképződésben

A mezenchimális őssejtek szerepe a tumorképződésben

2013. május